Cardiomyocyte Inducer Medium Kit

CardiOid series心肌细胞诱导试剂盒

1、 产品描述

模基生物CardiOid series心肌细胞诱导试剂盒采用经优化的GIWI分化策略，通过精确时序调控Wnt/β-catenin信号通路（阶段性的激活与抑制）驱动人多能干细胞向心肌细胞的高效定向分化。该体系模拟心脏发育过程：首先通过48小时的Wnt激活诱导心源性侧板中胚层特化与祖细胞扩增，随后经4天Wnt抑制阶段促进心肌前体细胞向搏动心肌谱系分化，最后通过8天的成熟培养及代谢筛选（无糖高乳酸处理）促使细胞发生肌节结构组装、电生理功能成熟及代谢模式转变（如MYH6向MYH7转换），最终在14-15天内获得具有同步自发搏动能力、高纯度（cTnT⁺）、电生理成熟的心肌细胞（iCMs）。试剂盒提供涵盖上述五个关键阶段的化学成分明确培养基，支持从1个24孔板规模起始分化并可维持培养至第20天，为心脏疾病建模、药物心脏毒性评估及机制研究提供了高度可重复且功能可靠的体外细胞模型。

2、 产品信息

3、 其他自备材料和试剂

4、 模基生物推荐用细胞系

H1、H9、HN4、H7、H6、iPSC 包皮来源、iPSC-THY1

5、 新手须知

H9和部分iPSC系中胚层分化能力受限，对于新手优先选择H1、H7和经过中胚分化验证的iPSC株系。

注意事项：在使用时应始终穿戴防护服，在处理诸如人体细胞或其他生物及有害物质时应遵循安全的实验室规程。

仅用于科学研究。

6、 使用说明

a)     实验用品

干细胞专用基质胶、干细胞完全培养基、CardiOid series 心肌细胞诱导试剂盒、TC处理24孔培养皿、iCMs select 心肌细胞解离试剂盒

b)      使用程序：

b.1、PSC细胞培养及诱导前传代

1、   根据不同PSC细胞系的特性从ESC＜60P、iPSCs＜50P中复苏一支细胞、经过两次高质量传代记作复苏后P3（干细胞培养操作见Mogengel®多能干细胞金牌培养基系列提供的PSC培养SOP）。

2、   当复苏后传代至第三代（P3）的多能干细胞状态符合分化要求时（表现为细胞克隆形态圆润、核质比适中（细胞核约占细胞面积的60%）、细胞间连接紧密且支原体检测为阴性），即可启动心肌定向分化。分化起始时，取六孔板中单孔细胞，以DPBS轻柔洗涤两次后，加入1 mL StemGrowth series水解酶温和消化液，于37°C条件下消化6-8分钟；随后加入2 mL HBSS或DMEM/F12基础培养基终止消化，轻柔吹打细胞集群2次并将其收集至15 mL离心管中，以120g离心5分钟；弃去上清，使用12 mL多能干细胞金牌培养基与12 μL StemGrowth series抗胁迫补充剂（1000x）的混合液重悬细胞沉淀，以每孔500 μL的悬液量接种至经基质胶包被并提前预热2小时的24孔板中，完成分化准备的细胞铺板步骤。

3、   接种于24孔板中24小时后，弃掉上清，每天每孔补充500 μL多能干细胞金牌培养基，直到细胞克隆密度达到90%以上。

注意！注意！PSC克隆出现问题、自分化及漂浮的情况应再启动复苏扩增一株，不可直接用于分化

b.2、侧板中胚层脉冲激活及扩增

当细胞融合度达到90%以上时，即可启动中胚层定向分化与扩增程序。分化第0天（D0），使用预温的HBSS或DMEM/F12培养基轻柔洗涤细胞两次，以彻底去除残留的白蛋白及代谢废物。随后，向每孔中加入500 μL中胚层激活培养基1，启动为期24小时的定时脉冲诱导，精确激活WNT等信号通路以特化心源性中胚层谱系。至分化第1天（D1/24h），准时吸弃上清，再次使用HBSS或DMEM/F12洗涤细胞两次，彻底清除上一阶段的诱导因子。之后，每孔换入1 mL中胚层扩增培养基2，继续培养24小时，以支持并扩增已定向的中胚层祖细胞群体。此中胚层诱导与扩增阶段总计持续48小时，为后续的心肌发生奠定必要的细胞基础。

b.3、心源中胚层激活及心肌前体细胞发生

1、   在中胚层激活与扩增阶段结束后，需使用TyplE消化3个孔细胞并通过qPCR验证分化效率。使用以下引物对检测核心中胚层标志基因：

Brachyury (T):  Forward: 5'-TATGAGCCTCGAATCCACATAGT-3'

Reverse: 5'-CCTCGTTCTGATAAGCAGTCAC-3'

PDGFRα：    Forward: 5'-AGCACCTTCGTTCTGACCTG-3'

Reverse: 5'-TATTCTCCCGTGTCTAGCCCA-3'

判定标准：当Brachyury与PDGFRα的mRNA表达量经ΔΔCt法计算（以内参β-Actin为基准）均高于内参120-1500倍时，表明中胚层分化成功，可立即切换至心源中胚层诱导培养基以启动心肌定向分化。此阈值确保下游心肌分化所需的前体细胞丰度与纯度，避免非心系细胞（如血系或骨系）污染。注：qPCR应使用SYBR Green法，反应体系含cDNA模板100 ng/反应，退火温度统一设为60°C，循环数40。每次运行需包含无模板对照（NTC）及熔解曲线分析以确认扩增特异性。

2、   经qPCR确认中胚层标志基因（Brachyury及PDGFRα）高表达后，弃去原培养基，使用预冷的HBSS/DMEM/F12轻柔洗涤细胞两次，以彻底清除残留分化因子及细胞碎片。每孔精确加入500 μL心源中胚层诱导培养基3（CardiOid CME Induce Medium 3），并于37°C/5% CO₂条件下继续培养。此后每日进行全量换液：先以HBSS/DMEM/F12洗涤清除凋亡细胞（避免死亡细胞聚集引发的“集体感应”凋亡效应），再补充新鲜预温的心源诱导培养基。此心源中胚层诱导阶段需持续4天。

3、   心源中胚层诱导4天后，弃去培养基，使用预冷的HBSS/DMEM/F12缓冲液轻柔洗涤细胞两次，以彻底清除代谢废物。随后每孔加入1 mL心肌前体细胞发生培养基（CardiOid CMP Formation Medium），并于37°C/5% CO₂条件下继续培养。此后每日遵循相同流程：先以缓冲液洗涤去除凋亡细胞（维持培养基洁净度），再补充1 mL新鲜预温的心肌前体细胞发生培养基。此阶段持续4天，与前期心源中胚诱导共同构成8天的核心分化周期。形态学验证：40倍显微镜下可见细胞集落色泽转为深棕至黑色，并出现黑色条状山脊样隆起，同时伴随细胞核浓缩变小、细胞间隙显著增大等特征性改变。

b.4、iCMs成熟及再接种

心肌前体细胞完成分化后，其代谢模式由糖酵解向脂肪酸β氧化转变；为促进其向成熟心肌分化并增强肌节组装，本体系通过调整碳源（如降低葡萄糖、增加脂肪酸/酮体、乳酸）优化代谢适应性。使用HBSS/DMEM/F12洗涤细胞两次后，将6 mL iCMs成熟培养基（iCMs Maturation Medium）与6 mL心肌前体细胞发生培养基按1:1混合，并加入12 μL StemGrowth抗胁迫补充剂（1000×），每孔加入500 μL混合培养基进行24小时适应性培养，以缓解代谢转换压力并维持细胞存活。24小时后更换为每孔1 mL纯iCMs成熟培养基，继续诱导3天。该阶段通过代谢重编程（激活PPARα/PGC-1α通路）驱动线粒体生物合成与肌原纤维精确排布，最终可观测到同步化早期搏动，标志功能性心肌细胞网络形成。

对于经代谢重编程诱导成熟并具备同步搏动功能的心肌细胞（iCMs），可进行2-3次再接种以用于共聚焦成像鉴定。首先将基质胶包被的共聚焦小皿或玻片于37°C预热12小时以活化细胞黏附位点。弃原培养基后，使用DPBS洗涤细胞一次，每孔加入500 μL iCMs Select心肌细胞解离试剂，37°C消化12-15分钟（至细胞间隙增大、胞体回缩）。弃去解离液，以心肌前体细胞发生培养基（含1×StemGrowth抗胁迫补充剂）轻柔重悬细胞（避免肌节断裂），最终将21孔细胞量接种于48个预处理的共聚焦小皿/玻片上（接种密度需保障细胞间电耦联）。24小时后更换为不含补充剂的心肌前体细胞发生培养基继续培养2天，促进细胞贴壁扩展及肌节结构重建，即可进行多标志物免疫荧光共定位分析（TNNT2/NKX2-5/SMA/TBX5/COL4），验证心肌细胞纯度、亚型特异性及胞外基质组装状态。

V1.3版

更新时间：2025/10/14