模基生物人结肠类器官培养基套装（扩增）

产品描述

模基生物人结肠类器官培养基套装（扩增）（Human Colonic Organoid Kit）是一款用于扩增人结肠类器官的完全培养基，扩增时的人结肠类器官主要由结肠干细胞和结肠祖细胞组成。结肠类器官在自我更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面，重现了体内结肠上皮的特征，因此是人结肠研究的理想体外模型。

产品信息

其他自备材料和试剂

人结肠类器官完全培养基使用说明 

1.收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻；

2.将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成 10ml 规格；

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

² 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期两年，注意避免反复冻融；

² 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用；

² 类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。

人结肠类器官的建立与传代培养

注意：涉及原代人体组织材料的研究必须遵守所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

Ø 原代人结肠类器官的建立

1.取样：使用离心管将原代人结肠组织收集在冰冷的原代组织储存液中，将组织样本保存在 4°C，直到开始分

离。

2.清洗：将组织样本转移至装有预冷DPBS缓冲液的培养皿中，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面粘液或残留的粪便，接着将结肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗2-3次。 将清洗后的肠组织剪碎至2-5 mm宽，随后转移至50ml离心管中，剧烈震荡30s (垂直上下震荡90 次一上一下算一次，约 1s 三次) 弃上清，重复3次。

3.消化：加入30 mL的DPBS 溶液中再加入150 μL 0.5M EDTA，至EDTA终浓度为2.5 mM。置4℃摇床上，80rpm，消化 60 min。

4.清洗：消化完成后，静置待肠段沉淀，弃上清。加入预冷DPBS，轻柔摇匀，静置后弃上清，重复2次以去除 EDTA。

5.重悬：加入30 mL预冷的含0.1%BSA的DPBS，涡旋30s，取上清70μm滤网过滤，收集穿过滤网的组织悬液，记为馏分1。重复收集2次，记为馏分2和馏分3。

6.收集：300g 离心力 4℃离心3min。

7.计数：弃上清，根据沉淀量分别使用0.1%BSA的DPBS重悬组织沉淀，取20μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g 离心力 4℃离心3min，弃上清后置于冰上。

8.用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每10μL 基质胶悬液包含100至200个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

9.将基质胶和组织细胞的混合悬液接种至24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。 

10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的人结肠类器官完全培养基（扩增），24孔板每孔加入500μL，避免破坏已凝固结构。

12.将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

13.每2~3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，人结肠类器官应在5至7天内建成。

Ø 人结肠类器官的传代培养和分化

1.  用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将结肠类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。

2.  用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。

3.  300×g，4℃离心 3 min，弃上清，用经过润洗液润洗的枪头加入 200 μL 类器官消化液并充分混匀，37℃条件下消化 1- 3 min，消化结束后加入 1 mL 上皮类器官基础培养基吹打混匀。

4.  300×g，4℃离心 3 min，弃上清，再次加入 1 mL 上皮类器官基础培养基并混匀。

5.  300×g，4℃再次离心 3min，弃上清后置于冰上。

6.  用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

7.  将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30 μL 左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

8.  将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 30 min 左右待基质胶凝固后取出。

9.  配制人结肠类器官扩增培养基。

10. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的人结肠类器官扩增培养基，24孔板每孔 500μL。

11. 将 24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，待新长出的类器官直径超过 100 μm 后可进行分化实验。

12. 分化前需要吸去24孔板培养孔中的人结肠类器官（扩增）培养基，并加入500 μL 提前配制的人结肠类器官（分化）培养基，分化通常需要 4 d 以上时间，分化期间每隔 2 d 更换一次分化培养基，分化完成后可进行后续实验。

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