NeuroCortex series 皮质脑类器官诱导试剂盒

产品描述

NeuroCortex series皮质脑类器官诱导试剂盒是模基生物专为脑皮质相关疾病建模、类脑计算及高级神经中枢机制机理等相关研究方向开发的一款谷氨酸能表达量更高的PSC诱导背侧前脑皮层类器官体系，通过简单的组分可以在60天内构建至少96个高髓鞘表达的成熟皮质区脑类器官。

产品信息

其他自备试剂

其他自备耗材

Mogengel推荐用细胞系

H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者来源DY043、iPSC-EGFP等。

渗透压

270-340 osM

新手须知

NeuroCortex series 脑类器官诱导试剂盒理论上可以形成至少100个脑类器官，但是建议第一次诱导以1个六孔板启动分化形成至少60-100个均一大小神经上皮球/理想形成率60%。

注意事项：在使用时应始终穿戴防护服，在处理诸如人体细胞或其他生物及有害物质时应遵循安全的实验室规程。

仅用于科学研究。

实验前建议

产品是无菌的，产品外包装是非无菌的，请在使用前对产品外包装充分消毒。

产品一经拆封，应妥善存放以确保产品的无菌性。

对要进行诱导的PSC进行干性检测，如SSEA-3/4+OCT4，对神经上皮诱导的2D细胞也可进行表征I鉴定验证神经上皮分化，如SOX2+ OCT4+ Nestin+ Nanog-。

使用说明：皮质脑类器官诱导培养

实验用品：基质胶、干细胞完全培养基、皮质脑类器官诱导培养基、超低黏附u底板/6孔培养皿其他类器官培养所需试剂、耗材；

Ø 2.使用程序

Ø 2.1PSC细胞培养及神经上皮干细胞NESC的二维诱导

1. 根据不同PSC细胞系的特性从ESC/＜60P、iPSCs＜50P中复苏一支细胞、经过两次高质量传代记作复苏后P3（干细胞培养操作见StemGrowth series / StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium培养SOP）

2. PSC传代后两天进行神经上皮诱导，观测细胞形态成小岛状克隆，细胞克隆密度低于30%、无单细胞胁迫生长样及应激态球状克隆团即可进行诱导。使用弃去干细胞培养基使用DMEM/F12润洗两次细胞去除漂浮细胞后每孔加入2m神经上皮诱导培养基，每2天换液一次，直到细胞克隆密度达到80%, 10x显微镜下观测克隆边缘圆润光滑、细胞核缩小且变多，诱导时间计3-4天。

注意！PSC克隆出现问题、自分化及漂浮的情况应再启动复苏扩增一株，不可直接用于分化。

2.1.1从EB球直接神经上皮诱导

① 根据不同PSC细胞系的特性从ESC/＜60P、iPSCs＜50P中复苏一支细胞、经过两次高质量传代记作复苏后P3（干细胞培养操作见StemGrowth series多能干细胞金牌培养基提供的PSC培养SOP）

② 将PSC细胞培养至80% 的克隆密度、克隆边界清晰圆润、细胞核质比正常即可进行EB诱导，DPBS洗涤细胞两遍后使每孔用500ul的StemGrowth series 水解酶温和消化液或StemGrowth series 消化液 消化6-10分钟，观测克隆变圆皱缩变亮、摇晃可见少量细胞脱离基质即可终止消化。

③ 吸弃消化液，如若使用水解酶消化导致细胞大量漂浮则不吸弃，使用等量的StemGrowth series多能干细胞金牌培养基终止消化。而无酶体系的StemGrowth series 消化液则吸弃后直接每孔加入500ul  StemGrowth series EBs 形成培养基重悬细胞后收集于15ml或50ml离心管中（根据消化液种类灵活选择）。

④ 水解酶消化后的细胞120g离心5分钟弃除上清后，加入按消化的孔数*500ul 的体积加入EBs形成培养基重悬并补充1000x到1x的StemGrowth series 抗胁迫补充剂，而无酶体系的StemGrowth series 消化液 消化后的细胞直接加入原重悬体系的（消化孔数*500ul）的体积的EBs培养基后补充1x的StemGrowth series 抗胁迫补充剂。

⑤ 将细胞悬浮液+ 1x StemGrowth series 抗胁迫补充剂加入加样槽中或10cm细胞培养皿，使用排枪每孔100ul加入超低粘附96孔u底培养皿中，封口膜包好后水平甩板机1500rpm离心5分钟，37度细胞培养箱培养过夜，第二天每孔加入100ul EBs(不含StemGrowth series 抗胁迫补充剂)形成培养基，EB形成总时间约48小时。

⑥ 第三天完全吸弃EBs形成培养基，每孔加入200ul神经上皮诱导培养基培养三天，第二天吸弃100ul再补液100ul去除培养代谢废物。

Ø 2.2神经球形成（直接从EB诱导神经上皮的方法不参考此步骤)

1. 将6ml StemGrowth series 水解酶温和消化液预热至RT后，放入生物安全柜，每孔使用1ml的DPBS洗涤诱导的神经上皮干细胞两次，每孔加入800ul-1000ul的StemGrowth series 水解酶温和消化液，放入培养箱消化5-8分钟，每4分钟观测一次细胞状态，细胞克隆边缘卷起、细胞间隙变亮且有少量细胞漂浮于消化液中即可终止消化。

2. 从侧壁处吸弃消化液，每孔加入1ml的神经球形成培养基重悬细胞后定容于12ml的神经球形成培养基+12 ul的StemGrowth series 抗胁迫补充剂，如若细胞消化过度大部分完全飘起则使用每孔1ml的DMEM/F12终止消化后120g/3min离心收集细胞后定容于12 ml的神经球形成培养基+12ul StemGrowth series 抗胁迫补充剂，注意:定容前台盼蓝染色检测细胞活性高于80%即可进行下一步操作。

3. 准备2个超低黏附96孔u底板，使用排枪每孔100ul细胞悬液加入孔中，封口膜包好后96孔板水平离心机 1500rpm/5min离心。

4. 离心结束细胞应聚集于孔的一侧，放入培养箱中培养24h后每孔再次加入100ul的神经球形成培养基不含StemGrowth series 抗胁迫补充剂，神经球形成诱导时间计2天。

5. 对于直接形成EB后诱导神经上皮的体系，完成3天的诱导后完全吸弃神经上皮诱导培养基每孔加入250ul神经球形成培养基诱导2天。

Ø 2.3神经莲座扩张(两种方案一致）

1. 当神经球直径达到相关标准时（200-600um），使用宽口200ul移液枪头吸出神经球于超低吸附6孔板中，每个孔最多容纳10个神经球，所以最少准备2个六块板启动神经莲座扩张。

2. 神经球进入6孔板中后，轻柔的每孔加入2ml神经莲座扩张培养基后，放入十字/旋转摇床80rpm/s上培养18天，每1-2天换液一次/每孔换液2ml。

Ø 2.4皮质脑成熟

当神经球中心和外侧出现黑色的斑点状结构说明神经莲座扩张到适合阶段，完全弃去神经莲座扩张培养基每孔加入2ml的皮质区脑成熟培养基放入十字/旋转摇床80rpm/s上培养18-26天/每2-3天换液一次即可用于鉴定和下游实验。成熟的脑类器官结构上IF染色可见TUJ1/SOX2标记的细胞形成VZ和SVZ样的结构，且高表达谷氨能相关基因，使用脑成熟培养基长期于摇床培养可以培养至120天中心细胞不出现凋亡。

当皮质脑培养至直径大于1mm以上时，需对其进行切割减少内部细胞凋亡的情况。使用锋利无钝口的2号手术刀片将一个1mm以上的皮质脑类器官切割成2-4块，DPBS洗涤一遍类器官后，使用宽口1000ul移液枪头转移至15ml离心管中自然沉降（约需要5-8min），吸弃DPBS上清后，加入神经莲座扩张培养基+1x StemGrowth series 抗胁迫补充剂转移入超低粘附六孔板80rpm/s 培养4天，每天换液。4天后加入更换为皮质区脑类器官成熟培养基120rpm/s 继续维持培养，可延长培养时间和类器官活性至180天。

更新日期：2025年03月18日