Human Placental Organoids Medium Kit Plus

人胎盘类器官培养基套装Plus

模基生物人胎盘类器官培养基（Human Placental Organoids Medium Kit Plus）是一款化学限定性培养基。其核心成分能精准模拟体内微环境，为患者来源的类器官（PDO）提供高效的生长支持与传代稳定性。本品能显著提高类器官培养成功率，确保模型的高保真度与遗传稳定性，忠实保留原发组织的组织学特征和分子表型，是推动胎盘机制研究、药物筛选及个性化医疗的理想工具。

2、 产品信息

3、 其他自备材料和试剂

注意：“-”为非模基生物产品，无对应货号，可选用符合实验室标准的同类产品。

4、 人胎盘类器官培养基套装使用说明

1、   收到类器官培养基后，将培养基置于4℃冰箱进行解冻；

2、   待培养基完全解冻后上下颠倒充分混匀，在生物安全柜或洁净工作台中根据日常需求量进行分装，推荐分装成10 mL/管；

3、   分装后的培养基请密封后储存于-20℃，使用时取出分装的培养基放置室温平衡后即可使用。

5、 人胎盘类器官的原代培养与传代培养

注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

a)     原代胎盘类器官的建立

1、 取6-8周胎盘组织样本，样本应在离体5 min内放入装有预冷的活组织保存液（2~8 ℃）的样本管中，样本需要被活组织保存液完全覆盖（如果样品已经放在其他缓冲液或培养基中，请用预冷的活组织保存液替换整个溶液）。低温（2~8 ℃）运输转移至实验室，尽量在一小时内处理样本。

2、 试剂、耗材准备：实验前先将基质胶放置4 ℃冰上解冻，提前预热正常组织消化液，同时取出培养基放置室温平衡。与细胞接触的离心管、试管或者塑料吸头需要用类器官培养防粘附润洗液润洗后使用。

3、 清洗：用含3 %双抗的上皮类器官基础培养基或DPBS/PBS冲洗组织2~3次。

4、 收集绒毛：使用刀片在10 cm皿中刮出绒毛，400 x g离心5min，去上清。

5、 消化：在37℃环境下，将绒毛沉淀在8 mL正常组织消化液中消化5分钟。使用100 μm滤网过滤绒毛悬液，收集滤出物为滤液①，使用20% FBS-DMEM/F12终止消化。

6、 消化：将滤液上方残余隐窝重复步骤5，收集滤液②。

7、 富集：合并滤液①和滤液②，400 xg离心5min，去上清。

8、 裂红：在可见红色沉淀的情况下，加入1 mL红细胞裂解液重悬沉淀，并在4℃下离心400 xg，3 min。如红细胞过多可延长裂解时间或重复此步骤。

9、 计数：弃上清，加入1 ml DMEM/F12重悬于1.5ml EP管中清洗绒毛细胞，胎盘绒毛细胞计数后根据绒毛细胞的数量加入适量基质胶，细胞与基质胶悬液应置于碎冰上防止基质胶凝固，保证基质胶的比例大于70 %以上。

注意：基质胶应保存在冰上以防止其凝固。尽快进行该过程。过度稀释基质胶，会影响固体胶滴的形成。推荐基质胶比例应>70 %（基质胶体积/总体积）。

10、 种胶：将基质胶和细胞的混合悬液点入培养孔板底部正中央，使用枪头稍微摊平胶滴，注意避免接触孔板侧壁。（推荐：96孔板接种3~10 μL/孔，48孔板接种10~30 μL/孔，24孔板接种30~50 μL/孔）。

注意：种胶前可以把枪头在冰上皮类器官基础培养基中润洗，避免基质胶在试管或移液器吸头中凝固。

11、 凝胶：将培养板倒置放入37 ℃和5% CO₂的培养箱中15~30 min，使基质胶凝固。

12、 待基质胶完全凝固后，沿孔板侧壁缓慢加入室温平衡的胎盘类器官完全培养基，避免破坏已凝固结构。（推荐：96孔板加入100 μL/孔，48孔板加入250 μL/孔，24孔板加入500 μL/孔）。

13、 将培养板置于37 ℃和5% CO₂的恒温培养箱中。

14、 换液：每隔2～3天更换一次培养基，小心地从孔中吸出培养基，并加入新鲜的经室温平衡的类器官完全培养基。

15、 密切观测类器官生长状态，理想情况下，培养7-10天可见200-300 μm直径大小的胎盘类器官。

b)      人胎盘类器官的传代培养

1、 试剂准备：提前准备基质胶4℃过夜融化，解冻人胎盘类器官培养基加入Y27632（5 μM）

2、 待类器官培养到直径为100 µm-200 µm大小时（或变黑不再增大时），可进行类器官的传代（每代约1~2周）。为避免传代时类器官损失，以下操作用到的耗材均需用润洗液润洗后使用。

3、 富集类器官：吸弃旧培养基，加入4℃预冷的等体积上皮类器官基础培养基，用细胞刮刀或者移液管吸头尖端轻轻刮下（或吹打）基质胶和类器官混合物，转移至15 mL离心管中，吹打5～10次，使类器官和基质胶分离，离心400 xg，5 min。

4、 消化：去除上清液加入5倍于基质胶和类器官混合物体积的类器官消化液，吹打混匀后置于37℃培养箱中消化5~10 min。取出吹打混匀，取10 μL混合液镜检是否消化成小的细胞团块（以3～10个小细胞团为准），消化不充分可适当延长消化时间。若要求细胞计数则需消化成单个细胞，可将消化时间延长至10 min以上。

5、 终止：消化完成后，加入5倍体积上皮类器官基础培养基吹打混匀以终止消化反应，400 xg离心5 min。

6、 清洗：吸弃上清液，用上皮类器官基础培养基清洗2次以去除残留的消化液。最后一次清洗可将类器官合并收集在1.5 ml离心管中。

7、 混胶：清洗完成后在离心沉淀中加入基质胶（70%）并在冰上混匀（混匀吹打的动作要轻柔，切忌产生大量气泡，常温混匀则需要控制在15秒内）。

8、 铺板：将基质胶和细胞的混合悬液点入培养孔板底部正中央，使用枪头稍微摊平胶滴，注意避免胶滴接触孔板侧壁。（推荐：96孔板接种3~10 μL/孔，48孔板接种10~30 μL/孔，24孔板接种30~50 μL/孔）。

注意：为防止基质胶升温凝固，此步骤应尽快完成。

9、 凝胶：将培养板倒置放入37 ℃和5% CO₂的培养箱中15~30 min，使基质胶凝固。

10、 待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入经室温平衡的人胎盘类器官完全培养基（推荐：96孔板加入

100 μL/孔，48孔板加入250 μL/孔，24孔板加入500 μL/孔）。

11、 将培养板置于37 ℃和5 % CO₂的恒温培养箱中。

12、 换液：每隔2～3天更换一次培养基，小心地从孔中吸出培养基，并加入新鲜的经室温平衡的类器官完全培养基。

13、 密切观测类器官生长状态。

                                                                        人胎盘类器官

  V2.3版