MA-0817H007L/S 模基生物小鼠结肠类器官培养基套装

模基生物小鼠结肠类器官试剂盒

产品描述

模基生物小鼠结肠类器官培养试剂盒（Mouse Colonic Organoid Kit）是一款用于扩增和分化小鼠结肠类器官的完全培养基。扩增时的小鼠结肠类器官主要由结肠干细胞和结肠祖细胞组成，分化后的小鼠结肠类器官由结肠吸收细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成。结肠类器官在自我更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面，重现了体内结肠上皮的特征，因此是小鼠结肠研究的理想体外模型。

产品信息

其他自备材料和试剂

小鼠结肠类器官完全培养基的制备

使用无菌操作技术配制小鼠结肠类器官的扩增或分化培养基。以配制10 mL为例配置小鼠结肠类器官扩增或分化培养基， 如所需量不同，可相应调整用量。

1.冰上解冻小鼠结肠类器官培养因子B (50x)，小鼠结肠类器官培养因子C (80x)和小鼠结肠类器官培养因子 D (100x)。

注意：解冻后，建议将小鼠结肠类器官培养因子B (50x)、小鼠结肠类器官培养因子C (80x)和小鼠结肠类器官培养因子D (100x)。分别分装后保存取用，避免反复冻融。

2.小鼠结肠类器官的扩增培养基：将 200 uL小鼠结肠类器官培养因子B (50x)，125 μL 小鼠结肠类器官培养因子C (250x) 和 100 μL 小鼠结肠类器官培养因子D (250x) 加 至 9.575 mL 小鼠结肠类器官基础培养基中，充分混合，配制成 10 mL 小鼠结肠类器官扩增培养基。

3.小鼠结肠类器官的分化培养基：将 200 μL 小鼠结肠类器官培养因子B (50x)，125 μL 小鼠结肠类器官培养因子C (250x) 加至 9.675 mL 小鼠结肠类器官基础培养基中，充分混合，配制成 10 mL 小鼠结肠类器官分化培养基。

注意：配制后的小鼠结肠类器官完全培养基可在 2-8°C 储存，建议在两周内使用。此外，小鼠结肠类器官培养因子B(50x)内含有细菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠结肠类器官的建立与传代培养

Ø 原代小鼠结肠类器官的建立

1.取样：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌条件下取出近盲肠端3~5cm结肠组织，用镊子去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含双抗的DPBS溶液中。

2.清洗：使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面粘液或残留的粪便，接着将结肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗。 将清洗后的肠组织剪碎至2-5mm宽，随后转移至50ml离心管中，剧烈震荡30s(垂直上下震荡90 次一上一下算一次，约 1s 三次) 弃上清，重复3次。

3.消化：加入30 mL的DPBS 溶液中再加入150 μL 0.5M EDTA，至EDTA终浓度为2.5mM。置4℃摇床上，80rpm，消化 60 min。

4.清洗：消化完成后，静置待肠段沉淀，弃上清。加入预冷DPBS，轻柔摇匀，静置后弃上清，重复2次以去除 EDTA。

5.重悬：加入30 mL预冷的含0.1%BSA的DPBS，涡旋30s，取上清70μm滤网过滤，收集穿过滤网的组织悬液，记为馏分1。重复收集2次，记为馏分2和馏分3。

6.收集：300g 离心力 4℃离心3min。

7.计数：弃上清，根据沉淀量分别使用0.1%BSA的DPBS重悬组织沉淀，取20μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g 离心力 4℃离心3min，弃上清后置于冰上。

8.用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每10μL 基质胶悬液包含100至200个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

9.将基质胶和组织细胞的混合悬液点入48孔板底部正中央，每孔15 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。 

10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠结肠类器官完全培养基，24孔板每孔500μL，避免破坏已凝固结构。

12.将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

13.每2~3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠结肠类器官应在5至7天内建成。