MA-0817H003L/S 模基生物人胃上皮类器官培养基套装

模基生物人胃上皮类器官试剂盒

模基生物人胃上皮类器官培养基套装

产品描述

模基生物人胃上皮类器官培养基套装（Human Gastric Epithelial OrganoidKit Plus）是一种化学定义的细胞培养基，用于建立和维持成体干细胞来源的人胃上皮类器官。胃上皮细胞的自我更新是由干细胞及其前体细胞的增殖驱动的。人类胃上皮类器官在结构、细胞类型组成和自我更新方面表现出了胃上皮的大部分特征。因此为研究人胃上皮稳态和疾病提供了前所未有的希望。

产品信息

其他自备材料和试剂

人胃上皮类器官完全培养基的制备

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻；

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格；

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

² 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期两年，注意避免反复冻融；

² 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用；

² 类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。

病人来源的人胃上皮类器官的原代培养

注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

Ø 原代人胃上皮类器官的建立

1.用离心管将正常人胃组织碎片收集在冰冷的原发组织储存溶液中。将组织样品保持在4℃，直到分离开始。

2.评估获得的组织碎片是否完全由上皮组成。如果存在脂肪或肌肉组织，请在解剖显微镜下使用手术剪刀或手术刀和镊子尽可能多地去除这些非上皮成分。如果没有脂肪或肌肉组织，请立即继续下一步。

3.用类器官基础培养基或DPBS冲洗组织两次。

4.使用手术剪刀或手术刀将组织切碎成1-3mm³的小碎片，置于细胞培养皿中。

5.在37℃下用10mL正常组织消化溶液在15mL离心管中消化组织片段，消化时间可变，从30min到1.5小时不等。仔细监测消化过程，可适当吹打取上清观察消化程度。当大多数组织片段能够通过1mL移液器吸头时，消化过程即完成。

6.将FBS加入组织消化混合物中，最终浓度为2%，并使用100 μm细胞过滤器过滤。

7.收集并在4°C下以250g离心过滤的细胞3min。在可见的红色沉淀的情况下，吸入上清液，并使用2mL红细胞裂解液重悬沉淀，在室温下裂解红细胞1min，并在4°C下以250g离心3min。

8.吸出上清液并将沉淀重悬于基础培养基中，在4°C下以250g离心3min，再次重复此步骤。

9.吸出上清液并将沉淀重悬于基质胶中。基质胶应保存在冰上以防止其凝固。尽快进行该过程。使用的基质胶的量取决于颗粒的大小。大约10，000个细胞应接种在25μL基质胶中。

10.不要过度稀释基质胶（基质胶比例应>70%（基质胶体积/总体积）），因为这可能会抑制固体液滴的正确形成。将含有类器官的基质胶铺在24孔细胞培养板的底部，每个液滴围绕孔中心约15-20μL。

注意：一旦类器官重悬于基质胶中，尽快进行种板，因为基质胶可能会在试管或移液器吸头中凝固。不要让基质颗粒接触管壁。

11.将培养板放入37°C和5%CO₂的培养箱中15-25min，让基质凝胶固化。

12.准备所需量的人胃上皮类器官完全培养基。

13.一旦基质胶滴凝固（15-25min），打开板并小心地向每个孔中加入250μL人胃上皮类器官完全培养基。

注意：不要将培养基直接添加到基质胶液滴的顶部，因为这可能会破坏已凝固结构。

14.将培养板置于37℃和5%CO₂的恒温培养箱中。

15.每隔3-4天更换一次培养基，小心地从孔中吸出培养基，并用新鲜的预热的类器官完全培养基代替它。

16.密切监测类器官生长状态，理想情况下，人胃上皮类器官应在5-8天内建成。

Ø 人胃上皮类器官的传代培养

1.用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5mLEP管中。

2.用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

3.250g离心力室温离心3min。

4.弃上清，使用类器官消化液或用机械破坏。对于使用类器官消化液的细胞解离，在类器官消化液中重悬类器官悬浮液，移液器反复上下吹打并置于37°C孵育，直至类器官解离。使用带滤芯枪头每2min反复上下吹吸8次，以帮助类器官解离。密切监视消化过程使在类器官解离液中的孵育时间最短。如发生机械故障，在1.5mL上皮类器官基础培养基中重悬类器官悬液。小心地用移液管吸取类器官悬浮液，反复上下30次，这将有助于消化。

注意:不要在类器官解离液中解离超过7min，因为这可能会导致较差的类器官的生长甚至破坏。根据经验，如果是小块细胞的混合物，可以观察到由10-50个细胞组成的细胞团，消化就完成了。

5.消化完成后，用1ml上皮类器官基础培养基进行一次冲洗，然后室温下250g离心3min。

6.弃上清，用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

7.将基质胶和类器官的混合悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔20-30uL左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

8.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育15min左右待基质胶凝固。

9.配制人胃上皮类器官完全培养基。

10.待基质胶完全凝固后，加入已配制好的人人胃上皮类器官完全培养基，24孔板每孔加入500uL完全培养基。

11.将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养，直到类器官需要进一步的实验。