product details
模基生物人结肠类器官培养基套装（扩增）
产品描述
模基生物人结肠类器官培养基套装（扩增）（Human Colonic Organoid Kit）是一款用于扩增人结肠类器官的完全培养基，扩增时的人结肠类器官主要由结肠干细胞和结肠祖细胞组成。结肠类器官在自我更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面，重现了体内结肠上皮的特征，因此是人结肠研究的理想体外模型。
产品信息
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产品名称 |
产品货号 |
规格 |
储存/运输 |
保质期 |
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人结肠类器官培养基套装（扩增）Plus |
MA-0817H001LP |
500ml |
-20℃ |
24 个月 |
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MA-0817H001LP |
100ml |
其他自备材料和试剂
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产品名称 |
产品货号 |
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模基生物金牌基质胶 |
082701/082703/082755 |
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上皮类器官基础培养基 |
MB-0818L07 |
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类器官培养润洗液 |
MB-0818L03L/S |
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模基生物基质胶分装预冷盒 |
AB-YL1005 |
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Fetal Bovine Serum (FBS) |
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EDTA (0.5 M, pH 8.0) |
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DPBS (1X), 液体，不含钙和镁 |
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70 μm细胞滤网 |
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1.收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻；
2.将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成 10ml 规格；
3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。
注意：
² 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期两年，注意避免反复冻融；
² 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用；
² 类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。
人结肠类器官的建立与传代培养
注意：涉及原代人体组织材料的研究必须遵守所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。
Ø 原代人结肠类器官的建立
1.取样：使用离心管将原代人结肠组织收集在冰冷的原代组织储存液中，将组织样本保存在 4°C，直到开始分
离。
2.清洗：将组织样本转移至装有预冷DPBS缓冲液的培养皿中，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面粘液或残留的粪便，接着将结肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗2-3次。 将清洗后的肠组织剪碎至2-5 mm宽，随后转移至50ml离心管中，剧烈震荡30s (垂直上下震荡90 次一上一下算一次，约 1s 三次) 弃上清，重复3次。
3.消化：加入30 mL的DPBS 溶液中再加入150 μL 0.5M EDTA，至EDTA终浓度为2.5 mM。置4℃摇床上，80rpm，消化 60 min。
4.清洗：消化完成后，静置待肠段沉淀，弃上清。加入预冷DPBS，轻柔摇匀，静置后弃上清，重复2次以去除 EDTA。
5.重悬：加入30 mL预冷的含0.1%BSA的DPBS，涡旋30s，取上清70μm滤网过滤，收集穿过滤网的组织悬液，记为馏分1。重复收集2次，记为馏分2和馏分3。
6.收集：300g 离心力 4℃离心3min。
7.计数：弃上清，根据沉淀量分别使用0.1%BSA的DPBS重悬组织沉淀，取20μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g 离心力 4℃离心3min，弃上清后置于冰上。
8.用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每10μL 基质胶悬液包含100至200个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。
注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
9.将基质胶和组织细胞的混合悬液接种至24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。
注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。
10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。
11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的人结肠类器官完全培养基（扩增），24孔板每孔加入500μL，避免破坏已凝固结构。
12.将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。
13.每2~3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，人结肠类器官应在5至7天内建成。
Ø 人结肠类器官的传代培养和分化
1. 用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将结肠类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。
2. 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。
3. 300×g，4℃离心 3 min，弃上清，用经过润洗液润洗的枪头加入 200 μL 类器官消化液并充分混匀，37℃条件下消化 1- 3 min，消化结束后加入 1 mL 上皮类器官基础培养基吹打混匀。
4. 300×g，4℃离心 3 min，弃上清，再次加入 1 mL 上皮类器官基础培养基并混匀。
5. 300×g，4℃再次离心 3min，弃上清后置于冰上。
6. 用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。
注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30 μL 左右。
注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。
8. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 30 min 左右待基质胶凝固后取出。
9. 配制人结肠类器官扩增培养基。
10. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的人结肠类器官扩增培养基，24孔板每孔 500μL。
11. 将 24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，待新长出的类器官直径超过 100 μm 后可进行分化实验。
12. 分化前需要吸去24孔板培养孔中的人结肠类器官（扩增）培养基，并加入500 μL 提前配制的人结肠类器官（分化）培养基，分化通常需要 4 d 以上时间，分化期间每隔 2 d 更换一次分化培养基，分化完成后可进行后续实验。
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